Fitoterapia |河南大学李士明教授、康文艺教授：黄花败酱中新环烯醚萜类化合物及其激活PI3K/Akt信号通路的降糖作用-河南大学学术发展部

Fitoterapia |河南大学李士明教授、康文艺教授：黄花败酱中新环烯醚萜类化合物及其激活PI3K/Akt信号通路的降糖作用

信息来源：发布日期：2023-07-11

Abstract

黄花败酱是生长在亚洲和北美地区的一种野生蔬菜和草本植物，已被证明具有促进健康的特性。环烯醚萜是黄花败酱中最具生物活性的植物化学物质之一，但对其深入研究较少。本文报道了从黄花败酱中分离得到的9个环烯醚萜类化合物（化合物1～9），其中2个为新化合物（化合物2和6）。采用NMR（1D&2D）、HRMS、IR和UV对9个环烯醚萜类化合物的结构进行了表征和证实。化合物2是一个五元环环烯醚萜，让人联想到断裂的碳-1和碳-2键。化合物6具有典型的单烯缬草环烯醚萜，但在C-11位置的5-脱氧葡萄糖片段在该属中并不常见。化合物1、2和9对3个T3-L1细胞的葡萄糖吸收有显著的促进作用（P＜0.01）。进一步的机制研究表明，化合物1通过激活PI3K/Akt信号通路，促进地塞米松处理的3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取。GLUT4 mRNA和蛋白的表达也上调。本研究结果为黄花败酱作为治疗高血糖的功能性食品提供了科学依据。

Introduction

黄花败酱（P. scabiosaefolia）属于缬草科，主要分布于亚洲东部和中部以及北美西北部地区。在东亚地区，黄花败酱嫩芽和嫩叶被用作蔬菜，两千多年来，人们一直使用整株成熟的黄花败酱来预防肝脏疾病。传统上，黄花败酱的根被用来控制炎症、脓肿和腹痛等。它被认为是安全的，在人类食用中没有报道的副作用。因此，黄花败酱因其促进健康的特性而被用作功能性食品，并可进一步开发为心理健康和长寿等领域的针对性医疗食品。

最近的药理学研究表明，糖尿病（DM）是胰岛素分泌受损和胰岛素抵抗的结果。胰岛素抵抗是许多代谢性疾病的共同病理生理基础。抗糖尿病作用可能通过降低胰岛素抵抗和增强胰岛素敏感性来实现。

在初步研究中，发现了两种来自黄花败酱的环烯醚萜类化合物具有降糖活性。在本研究中，对黄花败酱中环烯醚萜类化合物的及其相关的抗糖尿病作用进行了深入的探索。首次从黄花败酱中分离得到9个环烯醚萜类化合物，并用质谱（MS）和核磁共振谱（NMR）对其进行了完整的鉴定。9个分离的环烯醚萜类化合物中有2个为新化合物（图1中的化合物2和6）。7种已知化合物分别鉴定为(4β，8β)-8-甲氧基-3-甲基-10-亚甲基-2,9-二氧杂三环[4.3.1.0^3,7]癸烷-4-醇（1）、败酱皂甙-糖苷配基（3）、2'-O-反式-coumaroylloganin（4a）、2'-O-顺式-coumaroylloganin（4b）、2'-O-反式-coumaroylloganic acid（5a）、2'-O-顺式-coumaroylloganic acid（5b）、败酱皂甙-糖苷配基-11-O-2'-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷（7）、10-acetylpatrinoside（8）、patrinovalerosidate（9）。本研究评估了来自黄花败酱的9种环烯醚萜在3个T3-L1细胞中的抗高血糖作用和相关机制。

Results

本研究首次从黄花败酱中分离到9个环烯醚萜类化合物（图1），其中化合物2和6为新的环烯醚萜类化合物；化合物1和3是已知的环烯醚萜；另外五个化合物（4，5和7～9）是已知的环烯醚萜苷。化合物3～8的骨架为5,6-dihydrovaltrate hydrin。C-1和C-2键断裂形成了化合物2和9的骨架，而C-3和C-9之间的新环形成了化合物1的骨架。化合物1和2为环烯醚萜类化合物，3～9为环烯醚萜类糖苷，除化合物6的5-脱氧-β-D-呋喃葡萄糖的糖部分在C-11位置外，葡萄糖部分在C-1或C-11位置。化合物2为化合物9的苷元。化合物4和5在葡萄糖的C'-2上含有成对的反式或顺式-coumaroyl。并对其对葡萄糖消耗的作用及机制进行了评价。

图1 黄花败酱环烯醚萜类化合物1～9的化学结构

化合物1、2、3、8和9对3种T3-L1细胞活力的影响

采用MTT法研究了从黄花败酱中新分离的5种环烯醚萜类化合物对3T3-L1细胞的毒性作用。在100 μmol/L浓度下，化合物1、2、8和9没有表现出细胞毒性，化合物3也没有表现出＜25 μmol/L的细胞毒性（图2）。因此，选择100～12.5 μmol/L浓度下的化合物1、2、8和9，以及25～6.25 μmol/L浓度下的化合物3作为浓度，研究它们对地塞米松（Dex）处理的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响。

图2 化合物1、2、3、8和9对3种T3-L1脂肪细胞活力的影响

化合物1、2、3、8和9对地塞米松处理的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗的影响

采用GOD-POD法测定5种环烯醚萜类化合物对地塞米松处理的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖吸收的影响。结果显示，不同化合物组模型组细胞上清液葡萄糖含量均显著高于对照组，表明模型建立成功。与模型组比较，在100和50 μmol/L浓度下，化合物1、2、9对大鼠葡萄糖摄取有显著影响（P＜0.05，P＜0.01）。在25 μmol/L浓度下，化合物2和9能显著增加葡萄糖摄取（P＜0.01）。当浓度降低至12.5 μmol/L时，化合物9也有显著影响（P＜0.01）。综上所述，化合物1具有一定的剂量依赖性。化合物2和9在25、50和100 μmol/L浓度下显著促进葡萄糖吸收，化合物9在12.5 μmol/L浓度下也促进葡萄糖吸收，而化合物3和8在所有浓度下对葡萄糖吸收都没有影响（图3）。

图3 化合物1、2、3、8和9对地塞米松处理的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗的影响

化合物1对3T3-L1脂肪细胞胰岛素信号通路的影响

通过胰岛素信号通路中的蛋白表达，研究化合物1对地塞米松处理的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响机制。结果显示，与对照组相比，地塞米松组PI3K/Akt通路明显被抑制。与正钒酸钠（Van）组相似，化合物1在100 μmol/L时显著提高IRS、AKt、PI3K磷酸化水平和GLUT4表达。在50 μmol/L时，p-IRS和GLUT4的表达也得到了促进。（图4）

图4 化合物1对地塞米松处理的3T3-L1脂肪细胞胰岛素信号通路的Western blot结果

化合物1对3T3-L1脂肪细胞GLUT4 mRNA的影响

GLUT4是脂肪组织中最重要的葡萄糖转运蛋白，因此也研究了化合物1对GLUT4 mRNA表达的影响。与对照组比较，模型组GLUT4 mRNA转录量显著降低（P＜0.001），而化合物1在100 μmol/L时显著增强GLUT4 mRNA转录量。因此，化合物1通过改变GLUT4 mRNA的转录水平及其蛋白表达，促进地塞米松处理的3T3-L1细胞的葡萄糖摄取（图5）。

图5 化合物1对3T3-L1脂肪细胞GLUT4 mRNA的影响

Discussion

作为一种野生食用蔬菜和药用植物，黄花败酱因其具有较高的营养价值和促进健康的活性，如抗炎和抗衰老作用，有着悠久的消费历史。在非洲、亚洲和南美洲，它被用作多种草药组成的传统药物配方的关键草药。有研究表明，它可以降低LPS和IL-6的表达，降低血糖，增加脂肪代谢。以往对黄花败酱植物化学物质的研究表明，黄花败酱含有丰富的环烯醚萜类植物化学物质，这促使我们对该类环烯醚萜类化合物进行分离和鉴定，并进一步研究其抗糖尿病活性。

通过硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析、半制备高效液相色谱分离得到9个化合物，并用HR-ESI-MS、IR、UV、¹H、¹³C和2D NMR进行结构表征。除2个新化合物（化合物2和6）外，其余7个化合物的结构均通过光谱分析和文献报道数据得到了证实。化合物2是一种新的变形环烯醚萜类化合物，仅含有一个五元环，类似于断裂的C-1和C-2键，并且在C-1上连接一个异戊酰基团，在C-3上连接一个羟基。化合物6是一种新的环烯醚萜苷，在C-1上有异戊酰基团，在C-11上有5-脱氧葡萄糖片段，在该属中不常见。化合物1有一个氧原子作为碳-3和碳-8之间的桥梁。化合物4和5是两对E和Z异构体型环烯醚萜苷，分别与葡萄糖C-2'上的O-反式和O-顺式-coumaroyl相连。有趣的是，化合物2和3是化合物9和6的苷元。9个环烯醚萜类化合物均为首次从该植物中分离得到。除化合物1、3和9外，其余6种环烯醚萜类化合物均为首次从该属植物中分离得到。

既往研究表明，环烯醚酮可改善T2DM大鼠胰岛素抵抗，调节血脂，恢复NO和内皮素的动态平衡，对糖尿病性心脏病有预防作用。它们还通过PI3K/Akt/PKB信号通路对糖尿病小鼠的高血糖和高脂血症有抑制作用。环烯醚萜类化合物如马钱苷、莫诺苷和sververside通过降低氧化应激水平，有效阻止P65、ERK1/2、JNK1/2和P38蛋白的磷酸化和激活，并进一步抑制NF-кB和MAPKs炎症信号通路的激活，从而改善胰岛素抵抗，防止肝损伤。

与此同时，在前期研究中发现，25和50 μmol/L剂量下，败酱皂甙A和黄花败酱中的败酱皂甙可显著降低胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞上清中的葡萄糖水平（P＜0.001）。因此，进一步研究了分离的环烯醚萜化合物的潜在降糖作用，发现化合物1显著改善3T3-L1脂肪细胞模型的胰岛素抵抗，且呈剂量依赖性。化合物2和9促进了地塞米松处理的3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取，而环烯醚萜类化合物3和8在所有浓度下都对葡萄糖摄取没有影响。与化合物2的糖苷元相比，化合物9显示出最显著的抗糖尿病活性，这表明C-3连接的糖部分可能影响葡萄糖的摄取。

与胰岛素抵抗相关的主要途径是PI3K/Akt信号通路。胰岛素与靶细胞表面的胰岛素受体（InsR）结合，导致InsR的酪氨酸磷酸化，进而刺激细胞内胰岛素受体底物1（IRS-1）磷酸化。激活的IRS-1随后结合PI3K的调控亚基P85，然后激活PI3K的催化亚基P110，导致Akt磷酸化。Akt的磷酸化加速了GLUT4从细胞向细胞膜的转移。GLUT4蛋白是IRS-1/PI3K通路下游葡萄糖转运相关的关键蛋白，GLUT4水平的变化直接影响葡萄糖稳态。GLUT4与细胞膜的融合增加了葡萄糖的摄取。胰岛素的大部分代谢活动都经过PI3K通路的激活。该信号通路中任何一个环节的薄弱或抑制都可能导致胰岛素的生理作用受到抑制，从而导致胰岛素抵抗。

本研究发现化合物1通过上调p-IRS-1激活PI3K/Akt信号通路，从而上调p-Akt和GLUT4蛋白，促进葡萄糖运输。因此，化合物1可以通过激活PI3K/Akt信号通路调节葡萄糖转运，促进3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取。本研究结果为在黄花败酱中寻找更丰富的降糖活性成分提供了有价值的参考。

Conclusion

综上所述，本文首次从黄花败酱中鉴定出9个环烯醚萜类化合物，包括1个新的变形环烯醚萜G（2）和1个新的环烯醚萜苷类萜H（6），以及2个已知环烯醚萜（1、3）和5个已知环烯醚萜苷类化合物（4、5和7～9）。化合物1可以显著改善葡萄糖摄取，其机制是通过上调PI3K、p-IRS、p-Akt和GLUT4蛋白的表达，激活PI3K/Akt信号通路，改善地塞米松处理的3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖转运。

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