氮素
是植物生长发育必须的大量营养元素，是生物体中蛋白质和核酸等分子的重要组成部分。尽管地球大气中含有78.1％的氮气，但不能被绝大部分植物直接利用，因此农业生产高度依赖工业氮肥。然而，氮肥的生产需要大量的化石燃料，并且过度施用氮肥会造成土壤板结退化和水体污染，影响农业的可持续发展。生物固氮是自然界生物可用氮的最大天然来源，豆科植物与根瘤菌可以相互作用形成一个独特的器官，即共生根瘤。在根瘤中的共生固氮是地球生态系统中氮气还原为可被植物利用的氨的重要途径，每年贡献了60%以上的陆地生物固氮量，影响着农业和自然生态系统中的初级生产和碳汇，为减少对工业氮肥的依赖，发展绿色农业具有重要意义。共生固氮是一个高耗能的酶催化过程，植物本身光合作用固定的碳水化合物是共生固氮最主要的碳源和能量来源
（图1）
。因此，共生根瘤的固氮能力需要与豆科植物的碳源和能量水平相协调，以平衡共生固氮和其它生命过程的碳消耗和保证豆科植物在不同环境下的正常生长。然而，人们并不清楚豆科植物如何响应碳源和能量水平从而调控高耗能的生物固氮过程。
2022年12月2日，河南大学省部共建作物逆境适应与改良国家重点实验室王学路团队在Science上发表了题为
Phosphoenolpyruvate reallocation links nitrogen fixation rates to root nodule energy state
的研究长文，发现了大豆根瘤能量状态调控共生固氮的新机制。在根瘤碳源供应增加时，根瘤能量状态上升，该研究发现了新的能量感受器蛋白GmNAS1
（soybean nodule AMP sensor 1）
和GmNAP1
（GmNAS1-associated protein 1）
感受上升的能量状态，进而调控糖酵解中间产物磷酸烯醇式丙酮酸
（Phosphoenolpyruvate, PEP）
在大豆根瘤细胞中的分配方向，促进PEP转化为苹果酸为共生体供能从而增强固氮能力
（图1）
。
豆科植物根瘤固氮能力随环境变化而受到影响，在外界氧气和磷营养供应改变时，根瘤的固氮能力会进行迅速地调整，而此时根瘤的能量状态也会发生相应的变化，表明根瘤能量状态的变化可能是固氮能力改变的重要诱因 （Ching, 1976；Sa et al., 1991）。胱硫醚β合成酶（Cystathionine β-synthase，CBS）结构域是一类具有结合腺苷酸及其衍生物（包括AMP、ADP和ATP等）能力的保守功能域， CBS家族蛋白具有作为细胞能量感受器的潜力，如动物和酵母中的AMPK（Baykov et al., 2011；Gonzalez et al., 2020）。为了鉴定大豆根瘤中能量状态的感受器，作者筛选了71个CBS家族蛋白，鉴定到在根瘤中特异高表达的GmCBS22（GmNAS1）和GmCBS14（GmNAP1）。遗传分析发现，GmNAS1和GmNAP1功能缺失后不影响根瘤的形成和发育，但是完全抑制了根瘤碳源供应增加后固氮能力的上升。进一步研究发现，GmNAS1和GmNAP1通过感知细胞AMP水平来监测根瘤细胞能量状态， GmNAS1可以直接结合AMP从而与GmNAP1在线粒体膜上形成异源二聚体，在碳源供应增加导致根瘤能量状态上升时，AMP含量降低，促使GmNAS1-GmNAP1异源二聚体解离，形成GmNAS1-GmNAS1和GmNAP1-GmNAP1同源二聚体。
为了了解位于线粒体膜上的GmNAS1和GmNAP1是如何调控根瘤固氮能力的，作者通过免疫共沉淀偶联质谱分析鉴定到了一个与GmNAS1和GmNAP1相互作用的转录因子NF-YC亚基
（Nuclear Factor-Y C subunit）
GmNFYC10a
。发现在根瘤能量状态上升时，AMP水平下降形成的GmNAS1-GmNAS1和GmNAP1-GmNAP1同源二聚体会与GmNFYC10a互作并将其锚定到线粒体上，减少细胞核中的GmNFYC10a水平，进而抑制丙酮酸激酶（PK）基因表达
（图2）
。
光合产物以蔗糖的形式运送到根瘤之后，经过糖酵解途径生成中间产物PEP，之后PEP可以经过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
（PEPC）
和苹果酸脱氢酶
（MDH）
催化生成苹果酸为类菌体的固氮反应提供能量，也可以在丙酮酸激酶
（PK）
的催化下生成丙酮酸进入线粒体的三羧酸循环而产生ATP
（图1）
。碳源供应上升的高能状态下，GmNAS1/GmNAP1-GmNFYC10调控元件抑制PK基因转录，进而减少了PEP向丙酮酸的转化，使更多PEP转化为草酰乙酸和苹果酸，从而增强类菌体的碳源供应和根瘤固氮能力
（图2）
。
图2：根瘤中的新能量感受器调节PEP分配而协同调控碳源水平和固氮能力
综上所述，该研究揭示了大豆根瘤中的新型能量感受器GmNAS1/GmNAP1通过调控根瘤碳源的重新分配来调整根瘤固氮能力的分子机制。该机制使豆科植物可以在生长环境改变时，依据其体内碳源的可用性来及时调整根瘤固氮效能，从而维持植株体内的碳氮平衡，适应周围环境的变化。该研究为设计高效利用碳源而共生固氮提供了重要依据，有助于未来高效固氮作物的分子设计。
河南大学省部共建作物逆境适应与改良国家重点实验室、河南大学交叉学科高等研究院王学路教授为该论文的通讯作者，河南大学师资博士后柯小龙为第一作者。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、河南省中原学者项目以及河南大学经费的支持。
王学路教授领衔的河南大学“生物固氮和豆科生物学”团队，以豆科作物为主要研究对象，研究菌植互作的遗传、进化和分子机制；植物碳氮平衡调控机制、能量感受和分配调控根瘤发育和共生固氮能力的遗传和分子机制；豆科作物分子设计育种。2021年10月1日王学路团队在Science以Research Article形式发表了题为
Light-induced mobile factors from shoots regulate rhizobium-triggered soybean root nodulation
的研究论文, 揭示了光信号和光合产物调控菌植互作和根瘤发育不同方面的遗传和分子机制机制
（点击查看：
专家点评 | Science突破！河南大学王学路团队揭示光信号调控根瘤形成的机制
）
。该研究发现CCaMK-STF-FT模块整合地上光信号和地下共生固氮信号，调控根瘤形成的机制。该机制使宿主植物的根能够感知地上环境是否能可持续地为地下共生固氮提供必需能量，从而开启根部共生结瘤。该研究揭示了植物地上-地下协同发育的新机制，为设计在暗处也可以共生固氮的新型植物提供了关键技术手段，为优化生物圈碳-氮平衡提供了新思路。近期王学路团队还在大豆与根瘤菌匹配性的共进化遗传和分子机制
（Zhang et al., 2021, Nature Plants）
，环境胁迫调控共生根瘤发育的分子机制
（He et al., 2021, Molecular Plant）
，以及根瘤菌诱导的细胞核内复制的细胞学基础
（Fan et al., 2022, New Phytologist）
等方面取得了系列重要进展。
参考文献：
[1] T. M. Ching, Regulation of nitrogenase activity in soybean nodules by ATP and energy charge. Life Sci. 18, 1071-1076 (1976).
[2] T. M. Sa, D. W. Israel, Energy status and functioning of phosphorus-deficient soybean nodules. Plant Physiol. 97, 928-935 (1991).
[3] A. A. Baykov, H. K. Tuominen, R. Lahti, The CBS domain: a protein module with an emerging prominent role in regulation. ACS Chem. Biol. 6, 1156-1163 (2011).
[4] A. Gonzalez, M. N. Hall, S. C. Lin, D. G. Hardie, AMPK and TOR: The Yin and Yang of Cellular Nutrient Sensing and Growth Control. Cell Metab. 31, 472-492 (2020).
[5] T. Wang et al., Light-induced mobile factors from shoots regulate rhizobium-triggered soybean root nodulation. Science 374, 65-71 (2021).
[6] B. Zhang et al., Glycine max NNL1 restricts symbiotic compatibility with widely distributed bradyrhizobia via root hair infection. Nature plants 7(1), 73–86 (2021).
[7] C. He et al., GSK3-mediated stress signaling inhibits legume-rhizobium symbiosis by phosphorylating GmNSP1 in soybean. Mol. Plant 14, 488-502 (2021).
[8] W. Fan et al., Rhizobial infection of 4C cells triggers their endoreduplication during symbiotic nodule development in soybean. New Phytol. 234(3):1018-1030 (2022).
https://www.science.org/doi/10.1126/science.abq8591
专家点评
杨维才
院士
（中国科学院遗传与发育生物学研究所）
豆科植物与根瘤菌的结瘤共生固氮体系是自然界中固氮效率最高、农业生产应用最为广泛的生物固氮系统。揭示生物固氮机制是近年的科学前沿，是提高生物固氮效率和实现非豆科共生固氮的基础。
早在100多年前，德国科学家发现豆科植物与根瘤菌共生，将氮气转化成植物需要的氮素营养。而另一方面，豆科植物需要分配大量光合产物用于支撑根瘤的起始、发育和成熟根瘤中的固氮过程。新世纪以来，随着传统模式豆科植物苜蓿和百脉根基因组的解析，根瘤形成的调控机制得到了深入研究
（Roy et al., 2020）
。由于根瘤发育和固氮还原反应都是高耗能的过程，豆科植物如何根据环境和自身的碳氮状态来调控根瘤发育和成熟根瘤的固氮能力，从而平衡生物固氮和其它发育过程以及细胞其它生命活动之间的碳消耗，是共生固氮领域中值得深入探讨的重大科学问题。研究发现，光是共生根瘤发育和生物固氮必须的环境因子，并且在氧气供应和光照强度等环境条件发生改变时，豆科植物根瘤的固氮能力和能量状态会同时发生相应的变化，表明根瘤能量状态可能调控固氮能力，但相关遗传和分子机制仍不清楚
（Wang et al., 2021；Taylor et al., 2018；Ching, 1976；Ching et al., 1975）
。
近年来，河南大学王学路教授团队在豆科植物光信号和光合产物调控根瘤发育的独特分子机制，以及根瘤细胞通过能量感受并调控碳源分配和共生固氮能力方面取得了突破。该团队以大豆为研究系统，揭示了大豆中受光诱导表达的GmFTs
（FLOWERING LOCUS T）
和GmSTF3/4
（orthologs of LONG HYPOCOTYL 5）
从地上移动到地下，在根中被根瘤菌激活的共生信号关键组分CCaMK磷酸化激活，诱导根瘤形成的机制
（Light-induced mobile factors from shoots regulate rhizobium-triggered soybean root nodulation，Science, 2021）
。该机制该研究为设计打破光信号与光合产物偶联的新型植物提供了关键技术手段，为优化生物圈碳-氮平衡提供了新思路。
2022年12月2日，Science杂志以“Phosphoenolpyruvate reallocation links nitrogen fixation rates to root nodule energy state”为题，长文形式在此发表了该团队另一项突破性进展：在大豆根瘤中首次鉴定了一对新的能量感受器GmNAS1和GmNAP1蛋白。该研究还发现，大豆根瘤碳源供应增加时（如外源施加蔗糖或高光照处理），根瘤能量状态的上升，促使线粒体中的GmNAS1和GmNAP1蛋白由异源二聚体转换为同源二聚体，从而将一个转录因子GmNFYC10a锚定在线粒体上，抑制其进入细胞核激活丙酮酸激酶基因表达。这种抑制作用一方面减少了糖酵解过程的中间产物PEP向丙酮酸的转化，另一方面使更多PEP底物被催化为草酰乙酸和苹果酸。在根瘤细胞中，苹果酸是类菌体的主要碳源，其供应增加提升了根瘤的固氮能力。
这一发现首次揭示了根瘤碳源供给通过改变细胞能量状态调控固氮能力的分子机制，糖酵解过程中间产物PEP的流动分配在调控根瘤固氮能力中发挥了关键作用。豆科的祖先起源于大约距今6700万年前，为适应不断变化的环境条件，进化出独特的光合与固氮调控途径。进化分析表明，GmNAS1和GmNAP1仅存在于酰脲输出型豆科植物中，如大豆、菜豆和豇豆等。在苜蓿和百脉根等氨酰输出型豆科植物以及非豆科植物中均未发现其直系同源蛋白。因此，GmNAS1和GmNAP1蛋白感应高光照和能量水平的功能鉴定，对于深入研究豆科植物高效光合和固氮调控机制无疑具有开创性和指导意义。此外，以大豆作为优秀的豆科模式系统，进一步开展共生根瘤碳源合理分配机制研究，将为高效固氮的豆科作物设计和创建等等重要的理论基础。
这项发现是近年来我国科学家发现“豆科植物结瘤机制”以及“光信号调控根瘤形成的分子机制”之后，在共生固氮领域的又一重大突破。
参考文献：
S. Roy et al., Celebrating 20 years of genetic discoveries in legume nodulation and symbiotic nitrogen fixation. Plant Cell 32(1), 15–41 (2020).
T. Wang et al., Light-induced mobile factors from shoots regulate rhizobium-triggered soybean root nodulation. Science 374, 65-71 (2021).
B. N. Taylor et al., Light regulates tropical symbiotic nitrogen fixation more strongly than soil nitrogen. Nature Plants 4(9), 655–661 (2018).
T. M. Ching, Regulation of nitrogenase activity in soybean nodules by ATP and energy charge. Life Sci. 18, 1071-1076 (1976).
T. M. Ching et al., Energy state and dinitrogen fixation in soybean nodules of dark-grown plants. Plant Physiol. 55, 796-798 (1975).
专家点评
林圣彩
院士
（河南大学基础医学院；厦门大学生命科学学院）
豆科植物与根瘤菌形成的共生根瘤是新进化出的高耗能器官，豆科植物如何在不同能量状态下，在保证植物细胞正常生命活动需要的基础上，合理调控碳源分配用于高耗能的固氮还原反应的分子机制所知甚少。ATP是细胞生命活动的能量载体，其通过水解为ADP或AMP为细胞供能。细胞如何感知能量状态而调节自身代谢过程意义重大。AMP激活的蛋白激酶
（AMP-activated protein kinase，AMPK）
是目前发现的动物和酵母中主要的感知细胞能量水平的蛋白复合物，AMPK由催化亚基α、调节亚基β和γ组成，其中γ亚基上的胱硫醚β合成酶
（Cystathionine β-synthase，CBS）
结构域可逆地结合AMP、ADP和ATP，从而可以监测细胞的能量状态。当营养和能量缺乏时，细胞中ATP水平降低，AMP水平升高并与AMPKγ亚基结合，激活AMPK蛋白激酶活性，从而启动下游信号途径以应对细胞能量胁迫
（Xiao et al., 2007；Gonzalez et al., 2020）
。植物中，AMPK的同源蛋白SnRK1虽然也是响应营养和能量缺乏的主要因子，但目前的研究发现其并不能直接感受细胞中AMP浓度，而主要感受磷酸糖类，在6-磷酸海藻糖含量的降低时被激活
（Crozet et al., 2014；Broeckx et al., 2016）
。植物共生根瘤中是否存在可以直接感知细胞能量状态的能量感受器仍是一大谜题。
近日，河南大学王学路教授团队通过生化和遗传手段在大豆中鉴定到一对可以直接感受植物根瘤细胞能量状态，进而调控共生固氮能力的能量感受器GmNAS1和GmNAP1，从而回答了这一领域的关键问题。与AMPKγ亚基类似，GmNAS1和GmNAP1也具有四个串联的CBS结构域，在低能状态下，GmNAS1通过CBS结构域结合AMP从而与GmNAP1形成异源二聚体，而在根瘤能量状态上升时，AMP浓度的下降会促使AMP与GmNAS1解离，促进GmNAS1形成同源二聚体，此时GmNAP1也偏向形成同源二聚体。同源二聚化的GmNAS1和GmNAP1可以与一个关键转录因子GmNFYC10a相互作用并将其锚定到线粒体上，减少GmNFYC10a的细胞核积累，从而抑制丙酮酸激酶基因的转录，减少糖酵解中间产物PEP向丙酮酸的转化，使得更多PEP转化为草酰乙酸和苹果酸，增加类菌体的碳源供应来满足生物固氮的高耗能需求。这项突破性研究成果于2022年12月2日以长文发表在Science杂志上。
该研究首次揭示了植物中可直接感受细胞能量状态来调节细胞内碳代谢分配过程的能量感受器蛋白。与哺乳动物AMPK感受能量状态降低不同，GmNAS1和GmNAP1主要感受根瘤细胞能量状态的上升而发挥功能。此外，由于哺乳动物细胞中AMP和ADP的浓度远低于ATP
（AMP: 0.5-5 μM, ADP: 50-200 μM, ATP: 3000-8000 μM）
，AMPK需要可逆地结合AMP和ATP 以测定AMP/ATP比例，从而监测细胞能量状态
（Veech et al., 1979；Hellsten et al., 1999；McConell et al., 2005）
；而该研究发现大豆根瘤细胞中ATP浓度大约分别只有AMP和ADP浓度的10倍和2倍，AMP浓度变化可以显著影响根瘤细胞的腺苷酸能荷，因此GmNAS1主要结合AMP，微弱结合ADP而不需结合ATP就可以监测根瘤细胞的能量状态。这表明动物细胞和植物细胞采用各具特色的分子机制感受能量。
这项突破性进展，为发掘自主产生碳源的植物中更多的能量感受器并建立其信号通路提供了范例，将极大促进对细胞和个体水平碳源分配和代谢调控的进化和分子机制的解析。
参考文献：
B. Xiao, R. Heath, P. Saiu, F. C. Leiper, P. Leone, C. Jing, P. A. Walker, L. Haire, J. F. Eccleston, C. T. Davis, S. R. Martin, D. Carling, S. J. Gamblin, Structural basis for AMP binding to mammalian AMP-activated protein kinase. Nature 449, 496-500 (2007).
A. Gonzalez, M. N. Hall, S. C. Lin, D. G. Hardie, AMPK and TOR: The Yin and Yang of Cellular Nutrient Sensing and Growth Control. Cell Metab. 31, 472-492 (2020).
P. Crozet, L. Margalha, A. Confraria, A. Rodrigues, C. Martinho, M. Adamo, C. A. Elias, E. Baena-González, Mechanisms of regulation of SNF1/AMPK/SnRK1 protein kinases. Front. Plant Sci. 5, 190 (2014).
T. Broeckx, S. Hulsmans, F. Rolland, The plant energy sensor: evolutionary conservation and divergence of SnRK1 structure, regulation, and function. J. Exp. Bot. 67, 6215-6252 (2016).
R. L. Veech, J. W. Lawson, N. W. Cornell, H. A. Krebs, Cytosolic phosphorylation potential. J. Biol. Chem. 254, 6538-6547 (1979).
Y. Hellsten, E. A. Richter, B. Kiens, J. Bangsbo, AMP deamination and purine exchange in human skeletal muscle during and after intense exercise. J. Physiol. 520, 909-920 (1999).
G. K. McConell, R. S. Lee-Young, Z. P. Chen, N. K. Stepto, N. N. Huynh, T. J. Stephens, B. J. Canny, B. E. Kemp, Short-term exercise training in humans reduces AMPK signalling during prolonged exercise independent of muscle glycogen. J. Physiol. 568, 665-676 (2005).
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